木瓜蛋白酶提取实验方案

作者:admin 来源:未知 点击数: 发布时间:2019年07月08日

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  尝试设想 标题问题:木瓜卵白酶的提取,纯化分手及其生物学研究 一、 尝试道理: 木瓜卵白酶 (papain) 又称木瓜酶, 普遍具有于番木瓜的根、 茎、 叶和果实,未成熟果实的乳汁中含量最丰硕。是一种含疏基(-SH) 肽链的内切酶,具有卵白酶和酯酶的活性,有较普遍的特同性,对动 动物卵白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力;同时还具有合成的 功能,能把卵白水解物合成为类卵白质。工业用的木瓜卵白酶一般都 是未经纯化的多酶系统。 现已知经木瓜乳汁干燥而得的木瓜卵白酶至 少含有四种次要酶类:木瓜卵白酶( papain )、木瓜凝乳卵白酶 (chymopapain)、木瓜卵白酶 Ω(papaya proteinaseΩ)、木瓜 凝乳卵白酶 M(chymopapain M),此中木瓜凝乳卵白酶的含量最多, 占可溶性卵白的 45%。 木瓜卵白酶易溶于水和甘油,水溶液为无色或淡黄色,有时呈乳 白色; 几乎不溶于无机溶剂。 它的最适pH值为5.7 (一般3~9.5皆可) , 在中性或偏酸性时亦有感化;最适温度为55~60℃(一般10~85℃皆 可),耐热性强,在90℃时也不会完全失活;受氧化剂抑止,还原性 物质激活。 本尝试次要采纳无机溶剂沉淀法连系硫酸铵分级沉淀法来 提取番木瓜中的木瓜卵白酶。 无机溶剂沉淀法:无机溶剂能降低溶液的电解常数,从而添加蛋 白质分子上分歧电荷的引力,导消融度的降低,别的,无机溶剂与水 的感化,能粉碎卵白质的水化膜,故卵白质在必然浓度的无机溶剂中 的消融度差别而分手的方式。 无机溶剂分段沉淀法它常用于卵白质或 酶的提纯。利用的无机溶剂多为乙醇和丙酮。高浓度无机溶剂易惹起 卵白量变性失活,操作必需在低温下进行,并在插手无机溶剂时留意 搅拌平均以避免局部浓渡过大。 硫酸铵分级沉淀法: 硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和 部门纯化卵白质。 高浓度的盐离子在卵白质溶液中可与卵白质合作水 分子,从而粉碎卵白质概况的水化膜,降低其消融度,使之从溶液中 沉淀出来。各类卵白质的消融度分歧,因此可操纵分歧浓度的盐溶液 来沉淀分歧的卵白质。这种方式称之为盐析。盐析时溶液 PH 在木瓜 卵白酶等电点时(PI=8.75)则结果最好,盐浓度凡是用饱和度来表 示。硫酸铵因其消融度大,温度系数小和不易使卵白量变性而使用最 广。 木瓜卵白酶活力测定: 卵白酶在必然前提下不只可以或许水解卵白质中的肽键, 也可以或许水解 酰胺键和酯键, 因而可用卵白质某人工合成的酰胺及酯类化合物作为 底物来测定卵白酶的活力。本尝试选用酪卵白为底物,测定微生物蛋 白酶水解肽键的活力。酪卵白经卵白酶感化后,降解成相对分子质量 较小的肽和氨基酸,在反映夹杂物中插手三氯乙酸溶液,相对分子质 量较大的卵白质和肽就沉淀下来, 相对分子质量较小的肽和氨基酸仍 留在溶液中, 消融于三氯乙酸溶液中的肽的数量反比于酶的数量和反 应时间。 在 280nm 波长下测定溶液吸光度的添加, 就可计较酶的活力。 酶活力单元定义:在划定前提下,1min 内酶水解酪卵白释放出 相当于 1ug/ml 酪氨酸在 275nm 波利益的接收度为 1 个活力单元。以 0.1mol/l 盐酸溶液做空白,在 275nm 波利益测定空白溶液,待测定 液,对照品溶液的吸光度。 饱和硫酸铵消融曲线: 二、尝试材料与仪器: 材料:未成熟的番木瓜,无水乙醇,0.05mol/L 磷酸氢二钠; 0.1mol/L HC1, 乙二胺四乙酸二钠固体;氢氧化钠固体,酪卵白固体,半胱氨酸固体,氯化钠固 体,三氯乙酸固体,硫酸铵粉末,乙酸钠固体,和冰乙酸溶液,EDTA。 仪器:高速组织捣碎机,水浴箱,切确 心计心情,细密电子天平,低温冰箱。 pH 计,紫外分光光度计,高速冷冻离 三、手艺路线 尝试前预备:所需试剂的配制以及考马斯亮蓝 G-250 法测卵白 含量的预尝试,确保试验方式的可行性。 考马斯亮蓝 G-250 染液(0.01%) :称取 0.1g 考马斯亮蓝 G-250 固体粉末,溶于 50mL 95%乙醇中(95%乙醇取尝试室无水乙醇 47.5mL 加 2.5mL 蒸馏水)再插手 86% 磷酸 100mL,倒入 1000mL 容量瓶加蒸馏水定容至 1000mL。静置 1h 后,取棕 色试剂瓶用乙醇清洗清洁用滤纸过滤溶液后封存。 尺度卵白质溶液(0.1mg/mL):精确称取牛血清卵白 0.01g 用蒸馏水消融并稀释 到 100mL。现配现用。 酶庇护剂:精确称量 1.21g 的半胱氨酸于 100ml 蒸馏水中,调理 PH 至 9.0,溶 解半胱氨酸,再插手 0.1871g 的 EDTA,定容至 250ml,转入棕色瓶中。 500ml 的 2%(m/v)碳酸氢钠和 1mmol/L EDTA(pH 8.0)溶液:称取 10g 的碳酸氢钠 和 0.1871g 的 EDTA 溶于 500ml 蒸馏水中,调理 PH 至 8.0。 500ml的1mmol/L EDTA(pH 8.0)溶液:称取0.1871g的EDTA溶于500ml蒸馏水中, 调理PH至8.0。 酪卵白溶液: 称取酪卵白 0.6g 插手 0.05mol/L 磷酸氢二钠溶液 80mL(取 1.433g 磷酸氢二钠固体加 80mL 蒸馏水即得溶液) ,置滚水浴中煮 30min,不时搅拌,冷 ? 却至室温。加 1M 盐酸调理 PH 至 7.0 0.1 。加蒸馏水稀释到 100mL。用前设置装备摆设。 酶稀释液: A液 称取半胱氨酸0.264g,氯化钠1.17g,加蒸馏水25mL消融 ; B液 称取乙二胺四乙酸二钠0.112g,加蒸馏水10mL消融; 归并A、B液,搅拌平均,用4.0mol/L氢氧化钠溶液调理PH值到5.5,加蒸馏水稀 释至50mL 。用前设置装备摆设。 三氯乙酸溶液:取三氯乙酸0.9g,加乙酸钠1.495g和冰乙酸0.95mL,加水消融并 稀释至50mL。 4.2 木瓜卵白酶提取 4.2.1 粗酶液提取: ①用薄的不锈钢刀片沿未成熟的番木瓜的纵线mm,按照 果实大小的分歧,每个果实能够5~10条刀口。 ②将木瓜放于一个大烧杯中,使木瓜乳汁流入大烧杯中。 ③收集10ml乳汁插手190ml蒸馏水水,匀速温柔搅拌1h,得浆液。 ④浆液用8层纱布进行过滤,将所得液分装到离心管中,用离心计心情在3500r/min的 前提下,离心15min。 ⑤收集上清液至一干净的试管中,既得木瓜卵白酶原液,-20℃存取10ml酶原液 (编号为酶液1) 。 4.2.2 粗酶液纯化: 将粗液放入冰桶中,插手适量酶庇护剂( 0.04mol/L 的半胱氨酸和 0.004mol/L 的 EDTA ),混匀后如下表插手试剂 。 酶 液 +保 护剂 ( ml ) 硫酸铵 粉末 (至 终浓度 20% ) ( g) 硫酸铵 粉末 (至 终浓度 的 40% ) ( g) 酶液+ 庇护剂 ( ml ) 冷无水 乙醇 ( 65% ) ( ml ) 酶 原 液3 酶 原 液4 70+10 148.6 调理 ph 为 6.0 , 70+10 置于 冰桶 中 20 静 置 30min , 离 心 4000r/min , 30min , 弃 沉淀 22 静 置 30min , 离 取 1ml 9+1 18.6 4 ℃静 置过 夜 心 4000r/min , 酶 液 30min ,取 沉 淀 , 加 10ml 蒸 馏水 (酶 液 2) , -20 ℃ 保留 对留宿的酶液继续处置 酶液+ 庇护剂 ( ml ) 硫酸铵 粉末 (至终 浓度 20% ) ( g) 硫酸铵 粉末 (至终 浓度 40% ) ( ml ) 静 置 30min, 2.7 离心 4000r/min, 30min , 弃沉 淀 静 置 30min, 取 1ml 离心 酶液 透 析 袋 取酶 液并 编号 酶液 6, -20 ℃ 保留 透 析 袋 处 理 取酶 液并 编号 酶液 7, -20 ℃ 保留 酶 原 液 3 4 ℃ 4000r/min 取 1ml 9+1 静 置 过 夜 离心30 min ,取沉 淀,别离加 加 10ml 蒸 馏水 酶液 (酶 液 3) , -20 ℃ 保留 置 冰 桶 中 2.5 4000r/min, (酶 30min , 取 沉 液 4) , 处 淀 , 插手 -20 ℃ 理 10ml 蒸馏 水 保 存 酶 原 液 4 编 号酶 液 5 , -20 ℃保 存 4.2.3 透析: 8000-14000 标号的透析袋处置: ①取透析袋剪成恰当长度的小段。 放入大体积的 2%(m/v)碳酸氢钠和 1mmol/L EDTA(pH 8.0)中将透析袋煮沸 10 分钟。 ②用蒸馏水完全漂洗透析袋。放在 1mmol/L EDTA(pH 8.0)中将之煮沸 10 分钟。 ③冷却后,存放于 4 度,必需确保透析袋一直淹没在溶液内。从此时起取用透析 袋是必需戴手套,在透析袋内装满水然后排出,将之清洗清洁。 ④系好透析袋的一端,从另一端注入酶液 4、5,将透析袋放入蒸馏水中,在摇 床上震动,不时换蒸馏水。 ⑤直至向蒸馏水中插手氯化钡溶液,无沉淀发生及透析除盐完成。取出卵白质溶 液。 酶液 1 60%乙醇 酶液 3 45%饱和硫酸铵 酶液 4 透析膜处置 酶液 6 40%硫酸铵 番木瓜 酶液 2 60%乙醇 透析膜处置 酶液 5 酶液 7 4.3 木瓜卵白酶活性及总卵白含量测定: 4.3.1酶活性的丈量 酪氨酸尺度液和酶液处置 酪氨酸尺度液的制备:细密称取酪氨酸 0.005g 用 0.1mol/L 盐酸消融并定容至 100mL。 (此为 50ug/ml 的尺度液) 酶液的处置:取 0.3ml 酶液,加酶稀释液 2.7ml,稀释至 3mL。 操作 ?待测液:精确量取酶液溶液各 1.0mL,别离置于 2 支 10mL 带塞试管中,于 50 度水浴预热 5 分钟,精确插手 50 度预热的酪卵白溶液 5mL,当即振摇,置 50 度水浴中,切确反映 10min 后,加三氯乙酸溶液 5.0mL,振摇,于 50 度水浴中 放置 40min, 用干燥滤纸过滤, 滤液在 2h 内采用分光光度法以水为空白, 在 275nm 的波利益测定吸光度 A。 ?空白对照液:再切确量取酶液 1.0mL,置于 10mL 具塞试管中,于 50 度水 浴预热 5min, 精确插手 50 度预热的蒸馏水 5ml, 置 50 度水浴中, 插手三氯乙酸 溶液 5mL,振摇,于 50 度水浴中放置 40min,用干燥滤纸过滤,滤液在 2h 内采 用分光光度法以水为空白,在 275nm 的波利益测定吸光度 A0。 ?酪氨酸尺度液:另取酪氨酸对照溶液,以蒸馏水为空白,在 275nm 的波利益 测定吸光度 An。 待测液 空白対照液 酪氨酸尺度液 酶液 (ml) 1.0 1.0 1.0 50度预热 三氯乙酸 的 (ml) 50度水域 酪卵白溶 5.0 震摇, 过滤,滤液以水 A1 50度水浴 预热 液5ml 5.0 50度水 为对照在275nm A2 10min 5min 蒸馏水5ml 5.0 浴40min 测吸光值, 取酪氨酸溶液,以蒸馏水为空白,测定吸光度 吸光度 A A0 An 酶活力单元定义为在测定前提下,每 1 min 生成 1μ g/mL 酪氨酸所需的酶量。 公式: 酶活力(U/g)= A ? A0 W1 ? ? 11? n ? 1000 An W2 ? 10 式中: W1—酪氨酸尺度液每 1mL中含酪氨酸的量,单元为微克(μ g); 10—反映时间; 11—测定总体积; n—待测液的稀释倍数; 1000—毫克与克的转换倍数。 在上述前提下,每分钟水解酪卵白生成 1μ g酪氨酸所需的酶量为 1 个酶活力单 位。 4.3.2酶含量的丈量: 取 8 支 15 mL 试管,按下表插手试剂 管号 1 2 0.1 0.9 3 0.2 0.8 4 0.3 0.7 5 0.4 0.6 6 0.6 0.4 7 0.8 0.2 8 1.O 0 卵白质尺度溶液 (ml) 0 蒸馏水(ml) 1.0 考马斯亮蓝(ml) 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 卵白质含量(ug) A595 0 10 20 30 40 60 80 100 将试管摇匀,放置 2-3 分钟。用分光光度计比色测定吸光值 A595nm。(注 意应在 1 小时内完成比色),以 A595nm 为纵坐标,尺度卵白色质浓度为横坐标,绘 制尺度曲线。 对酶液进行稀释,同一酶液体积至100ml:别离取1ml 酶液1、酶液2、酶液3、 酶液4、酶液5、酶液6于6支清洁离心管中稀释至10ml(相当于木瓜卵白酶溶于 100ml蒸馏水中),再进行下步处置。 用倍比稀释的方式找出酶液测吸光度的最适倍数,使再从头取样丈量,取1ml酶 液于试管中,再加4ml考马斯亮蓝溶液,混匀,静置5min后在A595下测吸光度, 再按照尺度曲线算酶含量。

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