木瓜蛋白酶活力测定方法

作者:admin 来源:未知 点击数: 发布时间:2019年07月16日

  木瓜卵白酶活力测定方式_天然科学_专业材料。卵白酶活性测定方式

  木瓜卵白酶活力测定方式 别离细密量取酪卵白溶液5ml,置3支具塞试管中,置40℃水浴中保温10分钟,各细密插手 供试品溶液2ml,摇匀,置40℃水浴中,起头记时,精确反映1小时,当即细密插手三氯醋 酸溶液5ml,强力振摇混匀,置40℃水浴中放置30~40分钟,使沉淀的卵白质完全凝固,滤 过,滤液作为供试品溶液。细密量取酪卵白溶液5ml 置另一具试管,于40℃水浴中保温1小 时,细密插手三氯醋酸溶液5ml,强力振摇混匀,细密插手供试品溶液2ml,置40℃水浴中 放置30~40分钟,滤过,滤液作为空白溶液。照分光光度法(中国药典2000年版二部附录 IV A) ,以0.1mol/L 盐酸溶液为空白,在275nm 的波利益测定空白溶液、供试品溶液和对 照品溶液的接收度,按下式计较: 效价(单元/mg)=A/As*Cs*12/2*稀释倍数/W 式中 A 为供试品溶液的接收度减去空白溶液的接收度: As 为酪氨酸对照品溶液的接收度: Cs 为酪氨酸对照品溶液的浓度, ug/ml W 为供试品分量,mg; 在上述前提下,释放1ug 的酪氨酸的酶量为一个活力单元。 试剂 酪卵白溶液:取酪卵白1g,加0.05mol/L 磷酸氢二钠溶液50ml,置滚水浴中煮30分 钟,不时搅拌,冷至室温,加0.05mol/L 枸椽酸溶液调理 PH 至6.0±0.1,并敏捷搅拌,防 止酪卵白沉淀,用水稀释至100ml(临用新配) 。酶稀释液:取无水磷酸氢二钠3.55g,加水 400ml 消融,加乙二胺四醋酸二钠1.1g 和盐酸半胱氨酸2.74g,振摇消融,用1mol/L 盐酸 或1mol/L 氢氧化钠溶液调理 PH6.5±0.1,用水稀释至500ml,混匀(临用新配)三氯醋酸 溶液:取三氯醋酸17.99g,加醋酸钠29.94g 和冰醋酸18.9ml,加适量水消融后,加水使成 1000ml,摇匀。 酶活力测定对照品溶液的制备:细密称取已105℃干燥至恒重的酪氨酸对照品适量,用 0.1mol/L 盐酸溶液制成每1ml 中约含40ug 的溶液。供试品溶液的制备:取本品适量(约相 当于木瓜酶活力120万单元) ,细密称定,加酶稀释液振摇,制成每1ml 中含200~300单元 的溶液,摇匀。 淀粉酶活力测定 尝试手艺 2008-05-27 18:01:29 阅读213 评论0 字号:大中小 中 一、目标 淀粉是葡萄糖以 α-1,4糖苷键及 α-1,6 糖苷键保持的高分子多糖,是人类和动物的主要食物,也是食物、发酵、酿造、医药、 纺织工业的根基原料。 淀粉酶是加水分化淀粉的酶的总称,淀粉酶对淀粉的分化感化是工业上操纵淀粉的依 据,也是生物体操纵淀粉进行代谢的初级反映。小麦成熟期如遇阴雨气候,有的品种会发生 严峻的穗抽芽,形成庞大丧失,这是小麦种子中淀粉酶勾当的成果。因而,淀粉酶的活性测 定,具有理论和使用研究的意义。通过本尝试,进修酶活测定的一般方式,巩固并熟练分光 光度计的利用。 二、道理 淀粉酶次要包罗 α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和 R酶,它们普遍具有于动物、动物和微生物界。分歧来历的淀粉酶,性质有所分歧。动物 中最主要的淀粉酶是 α-淀粉酶和 β-淀粉酶。 α-淀粉酶随机感化于直链淀粉和支链淀粉的直链部门 α-1,4糖苷键, 零丁利用时最一生 成寡聚葡萄糖、α -极限糊精和少量葡萄糖。Ca2+能使 α-淀粉酶活化和不变,它比力耐热但不耐酸, pH3.6 以下可使其钝化。 β-淀粉酶从非还原端感化于 α-1,4糖苷键,碰到支链淀粉的 α-1,6 键时遏制。零丁感化时产品为麦芽糖和 β-极限糊精。β-淀粉酶是一种巯基酶,不需要 Ca2+及 Cl— 等辅助因子,最适 pH 偏酸,与 α-淀粉酶相反,它不耐热但觉耐酸,70℃保温15min 可使其钝化。 凡是提取液中 α-淀粉酶和 β-淀粉酶同时具有。能够先测定(α+β)淀粉酶总活力,然 后在70 ℃加热15min,钝化 β-淀粉酶,测出 α-淀粉酶活力,用总活力减去 α-淀粉酶活力,就 可求出 β-淀粉酶活力。 淀粉酶活力大小可用其感化于淀粉生成的还原糖与3,5-二硝基水杨酸的显色反映来测 定。还原糖感化于黄色的 3,5-二硝基水杨酸生成棕红色的3-氨基-5硝基水杨酸, 生成物颜色的深浅与还原糖的量成反比。 以每克样品在必然时间内生成的 还原糖(麦芽糖)量暗示酶活大小。 三、仪器、试剂和材料 1.仪器 (1)电子顶载天平 (2)研钵 (3)容量瓶100mL2个 (4)具塞刻度试管25Ml15支 (5)试管8支 (6)吸管1mL3支,2mL12支,5mL1支 (7)离心计心情 (8)离心管 (9)恒温水浴锅 (10)分光光度计 2.试剂 (1)1%淀粉溶液 (2)0.4mol/L 氢氧化钠 (3)pH5.6柠檬酸缓冲液称取柠檬酸20.01g,消融后定容至1000mL,为 A 液。称取柠檬酸钠29.41g,消融后定容至1000mL,为 B 液。取 A 液13.7mL 与 B 液 26.3mL 混匀,即为 pH5.6之缓冲液。 (4)3,5-二硝基水杨酸切确称取1g3,5-二硝基水杨酸溶于20mL1mol/L 氢氧化钠中,插手50mL 蒸馏水,再插手30g 酒石酸钾钠,待消融后用蒸馏水稀释至 100Ml ,盖紧瓶塞,防止 CO2进入。 (5) 麦芽糖尺度液 (1mg/ml) 称取0.100g 麦芽糖, 溶于少量蒸馏水, 定容至100mL。 3.材料 萌生3天的小麦芽。 四、操作步调 1.酶液提取 称取2g 萌生3天的小麦种子(芽长1cm 摆布) ,置研钵中加少量石英砂和2m1 摆布蒸馏水,研成匀浆,无损地转入100m1容量瓶中,用蒸馏水定容至100m1,每隔 数分钟振荡1 次,提取20min。3000r/min 离心 l0min,转出上清液备用。 2.a-淀粉酶活力测定 (1)取试管4支,标明2支为对看管,2支为测定管。 (2)于每管中各加酶液 lml,在70℃士0.5℃恒温水浴中精确加热15min,钝化 β -淀粉酶。取出后敏捷用流水冷却。 (3)在对看管中插手4m10.4mol/L 氢氧化钠。 (4)在4支试管中各插手1mlpH5.6的柠檬酸缓冲液。 (5)将4支试管置另一个40℃士0.5℃恒温水浴中保温15min,再向各管别离插手40 ℃下预热的1%淀粉溶液2m1,摇匀,当即放入40℃恒温水浴精确计时保温5min 。取出后向测定管敏捷插手4ml0.4mol/L 氢氧化钠,终止酶勾当,预备测糖。 3.淀粉酶总活力测定 取酶液5ml,用蒸馏水稀释至100m1,为稀释酶液。另取4支试管编号,2支为对照, 2 支为测定管。然后插手稀释之酶液 lml。在对看管中插手4m10.4mol 氢氧化钠。4支 试管中各加1 mlpH5.6之柠檬酸缓冲液。以下步调反复 α-淀粉酶测定第(5)步的操作,同样预备 测糖。 4.麦芽糖的测定 (1)尺度曲线支,编号。别离插手麦芽糖尺度液(lmg/ml) 0, 0.2,0.6,1.0,1.4,1.8,2.0ml,然后用吸管向各管加蒸馏水使溶液达2.0ml ,再各加3,5一二硝基水杨酸试剂2.0m1,置滚水浴中加热5min。取出冷却,用蒸馏 水稀释至 25m1。混匀后用分光光度计在520nm 波长下进行比色,记实吸光度。以吸光度为纵 坐标,以麦芽糖含量( mg)为横坐标,绘制尺度曲线m1,别离放入响应的8支25ml 具塞刻度试管中,各插手2m13,5二硝基水杨酸试剂。以下操作同尺度曲线制造。按照样品比色吸光度,从尺度曲线查出 麦芽糖含量,最初进行成果计较。 (A—A0)xVT 五、成果处置 式中 A 为 a-淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖(mg) ; Ao 为 a-淀粉酶的对看管中麦芽糖量(mg) ; B 为(a 十 β)淀粉酶配合水解淀粉生成的麦芽糖(mg) ; Bo 为(a 十 β)淀粉酶的对看管中麦芽糖(mg) ; VT 为样品稀释总体积(ml) ; VU 为比色时所用样品液体积(ml) ; W 为样品重(g) 。 六、留意事项 (1)酶反映时间应精确计较。 (2)试剂插手按划定挨次进行。 七、思虑题 1.淀粉酶活性测定道理是什么? 2.酶反映中为什么加 pH5.6的柠檬酸缓冲液?为什么在40℃进行保温? 3.测定酶活力,应留意什么问题? 一、目标 淀粉是葡萄糖以 α-1,4 糖苷键及 α-1,6 糖苷键保持的高分子多糖,是人类和动物的主要食物,也是食物、发酵、酿造、医药、 纺织工业的根基原料。 淀粉酶是加水分化淀粉的酶的总称,淀粉酶对淀粉的分化感化是工业上操纵淀粉的依 据,也是生物体操纵淀粉进行代谢的初级反映。小麦成熟期如遇阴雨气候,有的品种会发生 严峻的穗抽芽,形成庞大丧失,这是小麦种子中淀粉酶勾当的成果。因而,淀粉酶的活性测 定,具有理论和使用研究的意义。通过本尝试,进修酶活测定的一般方式,巩固并熟练分光 光度计的利用。 二、道理 淀粉酶次要包罗 α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和 R酶,它们普遍具有于动物、动物和微生物界。分歧来历的淀粉酶,性质有所分歧。动物 中最主要的淀粉酶是 α-淀粉酶和 β-淀粉酶。 α-淀粉酶随机感化于直链淀粉和支链淀粉的直链部门 α-1,4 糖苷键,零丁利用时最一生 成寡聚葡萄糖、α -极限糊精和少量葡萄糖。Ca2+能使 α-淀粉酶活化和不变,它比力耐热但不耐酸,pH3.6 以下可使其钝化。 β-淀粉酶从非还原端感化于 α-1,4 糖苷键,碰到支链淀粉的 α-1,6 键时遏制。零丁感化时产品为麦芽糖和 β-极限糊精。β-淀粉酶是一种巯基酶,不需要 Ca2+及 Cl— 等辅助因子,最适 pH 偏酸,与 α-淀粉酶相反,它不耐热但觉耐酸,70℃保温 15min 可使其钝化。 凡是提取液中 α-淀粉酶和 β-淀粉酶同时具有。能够先测定(α+β)淀粉酶总活力,然后 在 70 ℃加热 15min,钝化 β-淀粉酶,测出 α-淀粉酶活力,用总活力减去 α-淀粉酶活力,就 可求出 β-淀粉酶活力。 淀粉酶活力大小可用其感化于淀粉生成的还原糖与 3,5-二硝基水杨酸的显色反映来测 定。还原糖感化于黄色的 3,5-二硝基水杨酸生成棕红色的 3-氨基-5硝基水杨酸, 生成物颜色的深浅与还原糖的量成反比。 以每克样品在必然时间内生成的 还原糖(麦芽糖)量暗示酶活大小。 三、仪器、试剂和材料 1.仪器 (1)电子顶载天平 (2)研钵 (3)容量瓶 100mL2 个 (4)具塞刻度试管 25Ml15 支 (5)试管 8 支 (6)吸管 1mL3 支,2mL12 支,5mL1 支 (7)离心计心情 (8)离心管 (9)恒温水浴锅 (10)分光光度计 2.试剂 (1)1%淀粉溶液 (2)0.4mol/L 氢氧化钠 (3)pH5.6 柠檬酸缓冲液称取柠檬酸 20.01g,消融后定容至 1000mL,为 A 液。称取柠檬酸钠 29.41g,消融后定容至 1000mL,为 B 液。取 A 液 13.7mL 与 B 液 26.3mL 混匀,即为 pH5.6 之缓冲液。 (4)3,5-二硝基水杨酸切确称取 1g3,5-二硝基水杨酸溶于 20mL1mol/L 氢氧化钠中,插手 50mL 蒸馏水,再插手 30g 酒石酸钾钠,待消融后用蒸馏水稀释至 100Ml ,盖紧瓶塞,防止 CO2 进入。 (5)麦芽糖尺度液(1mg/ml)称取 0.100g 麦芽糖,溶于少量蒸馏水,定容至 100mL。 3.材料 萌生 3 天的小麦芽。 四、操作步调 1.酶液提取 称取 2g 萌生 3 天的小麦种子(芽长 1cm 摆布) ,置研钵中加少量石英砂和 2m1 摆布蒸馏水,研成匀浆,无损地转入 100m1 容量瓶中,用蒸馏水定容至 100m1,每隔 数分钟振荡 1 次,提取 20min。3000r/min 离心 l0min,转出上清液备用。 2.a-淀粉酶活力测定 (1)取试管 4 支,标明 2 支为对看管,2 支为测定管。 (2)于每管中各加酶液 lml,在 70℃士 0.5℃恒温水浴中精确加热 15min,钝化 β -淀粉酶。取出后敏捷用流水冷却。 (3)在对看管中插手 4m10.4mol/L 氢氧化钠。 (4)在 4 支试管中各插手 1mlpH5.6 的柠檬酸缓冲液。 (5)将 4 支试管置另一个 40℃士 0.5℃恒温水浴中保温 15min,再向各管别离插手 40 ℃下预热的 1%淀粉溶液 2m1,摇匀,当即放入 40℃恒温水浴精确计时保温 5min 。取出后向测定管敏捷插手 4ml0.4mol/L 氢氧化钠,终止酶勾当,预备测糖。 3.淀粉酶总活力测定 取酶液 5ml,用蒸馏水稀释至 100m1,为稀释酶液。另取 4 支试管编号,2 支为对照, 2 支为测定管。然后插手稀释之酶液 lml。在对看管中插手 4m10.4mol 氢氧化钠。4 支试 管中各加 1 mlpH5.6 之柠檬酸缓冲液。以下步调反复 α-淀粉酶测定第(5)步的操作,同样预备测 糖。 4.麦芽糖的测定 (1)尺度曲线 支,编号。别离插手麦芽糖尺度液(lmg/ml) 0, 0.2,0.6,1.0,1.4,1.8,2.0ml,然后用吸管向各管加蒸馏水使溶液达 2.0ml ,再各加 3,5 一二硝基水杨酸试剂 2.0m1,置滚水浴中加热 5min。取出冷却,用蒸馏 水稀释至 25m1。混匀后用分光光度计在 520nm 波长下进行比色,记实吸光度。以吸光度为纵坐 标,以麦芽糖含量( mg)为横坐标,绘制尺度曲线 中酶感化后的各管溶液 2m1,别离放入响应的 8 支 25ml 具塞刻度试管中,各插手 2m13,5二硝基水杨酸试剂。以下操作同尺度曲线制造。按照样品比色吸光度,从尺度曲线查出 麦芽糖含量,最初进行成果计较。 (A—A0)xVT 五、成果处置 式中 A 为 a-淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖(mg) ; Ao 为 a-淀粉酶的对看管中麦芽糖量(mg) ; B 为(a 十 β)淀粉酶配合水解淀粉生成的麦芽糖(mg) ; Bo 为(a 十 β)淀粉酶的对看管中麦芽糖(mg) ; VT 为样品稀释总体积(ml) ; VU 为比色时所用样品液体积(ml) ; W 为样品重(g) 。 六、留意事项 (1)酶反映时间应精确计较。 (2)试剂插手按划定挨次进行。 七、思虑题 1.淀粉酶活性测定道理是什么? 2.酶反映中为什么加 pH5.6 的柠檬酸缓冲液?为什么在 40℃进行保温? 3.测定酶活力,应留意什么问题?

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